哪种荧光显微镜技术最适合

荧光显微镜技术

荧光宽场显微镜

荧光宽场显微镜是最常见和最简单的荧光显微镜形式。准直（非会聚或发散）激发光离开显微镜物镜，均匀照亮整个（宽）视场。向物镜返回的荧光被收集并聚焦到相机上进行可视化。以与荧光收集相反的方向照射样品称为“Epi”照射。因此，这些有时被称为落射荧光显微镜。

点扫描共聚焦显微镜

点扫描共聚焦显微镜是第一个结合光学切片的荧光显微镜技术。光学切片是指从相对较厚的三维样品中的单个薄平面提取光的能力；类似于 MRI 或 CT 扫描仪。这是通过将激发光聚焦到样品中的一个点并光栅扫描该点以逐个像素地构建最终图像来实现的。收集到的荧光在到达检测器之前通过针孔。针孔经过专门放置，仅允许来自焦平面的光到达检测器，并且排除了来自上方或下方的所有光。

并行共聚焦显微镜（旋转盘）

并行共聚焦显微镜（旋转盘）提高了获取共聚焦图像的速度。逐个像素地组装图像很慢；因此，某些共聚焦显微镜使用并行化来提高性能。在旋转圆盘显微镜中，包含许多孔的金属圆盘通过激发光路旋转。每个孔对应于样品中的不同位置。由于一次照明不止一个孔，因此可以更快地获取图像。

2-光子显微镜

2-光子显微镜试图解决宽场和共焦显微镜的两个缺点。首先，宽场和共聚焦显微镜通过样品的整个轴向体积投射激发光。因此，当获取大量光学切片时，整个样品中的所有荧光团都不断地暴露在光线下，而不仅仅是焦点体积中的荧光团。这导致更快速的光漂白和信号强度的降低。2-光子显微镜将激发（和漂白）限制在一个焦点上。这是通过使用例如红光而不是蓝光来激发GFP分子来实现的. 因为红光的能量大约是蓝光的一半，所以需要两个红光光子来激发 GFP，而只需要一个蓝光光子。只有在物镜的焦点处才能建立足够高密度的红光子来实现这一点。

使用红光还有第二个优势：红光可以更深入地渗透到生物组织中。为了证明这一点，只需将手电筒放在手掌上即可。虽然白光进入您的手，但只能看到橙色/红色光从组织中射出。因此，2 光子可以更深入地成像到厚组织中。

光片显微镜

光片显微镜 通常利用两个或多个物镜的配置来创建激发光的薄片，该激发光垂直于收集荧光的成像物镜传播。与 2 光子显微镜一样，一次仅激发样品的一个焦平面，从而限制了光漂白。与宽场类似，整个视野一次被激发，并在一次相机曝光中被捕获。这比在共焦或 2 光子显微镜中依赖光栅扫描要快得多。

全内反射显微镜 (TIRF)

全内反射显微镜 (TIRF) 是一种仅用于激发位于盖玻片旁边的非常薄的荧光分子层的技术。光以一定角度通过盖玻片投射，使得当它到达玻璃盖玻片和水性缓冲液中的样品之间的界面时，它被完全反射。这种反射是由于玻璃和浸入样品的类水缓冲液之间的折射率不匹配而发生的。虽然激发光被完全反射，但能量通过仅在几百范围内激发荧光团的渐逝波传播到样品中纳米玻璃/水界面。

超分辨率显微镜

超分辨率显微镜允许在光学显微镜的衍射（分辨率）极限以下成像。由于光的波动性，一个无限小的光点在通过显微镜的光学器件到达检测器之前会模糊成一个 200-300nm 大小的光点。这意味着位于衍射极限内的两个或多个物体将在最终图像中显示为一个物体。在过去的二十年中，已经开发了许多允许亚衍射极限成像的技术。大多数情况下，这些技术可将光学显微镜的分辨率提高 2-10 倍。